近年来，不孕不育已成为影响人类生殖健康的重大问题，根据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）最新标准，不育可以定义为夫妇同居1年以上，在未采取任何避孕措施的条件下女方并未怀孕的现象。在全世界范围内有五千万的夫妻面临生育问题，其中男性因素约占30％-55％。弱畸精子症，作为临床上常见的一类导致男性不育的疾病表型，受到越来越多的关注。
作为弱畸精子症的一种类型，精子鞭毛多发形态异常（Multiple Morphological Abnormalities of theFlagella, MMAF）主要表现为精子尾部鞭毛的多种畸形，包括无尾、短尾、卷尾、折尾及不规则尾等形态，同时伴有精子活力降低或数目的减少。先前的研究发现这是一类与遗传变异有着很大相关性的疾病。复旦大学附属妇产科医院、遗传工程国家重点实验室的张锋教授研究团队针对畸形精子症建立多中心的国际合作，近年来陆续发现并报道了一系列导致MMAF的基因，包括CFAP43，CFAP44，CFAP65，SPEF2，TTC21A，TTC29等。然而，这些致病基因也仅仅只能解释大约35%-60%的病例。由此可见，MMAF是一类具有很大遗传异质性的疾病，更多的潜在致病基因有待进一步挖掘。
2020年7月2日，复旦大学张锋教授和日本大阪大学伊川正人教授在The American Journal ofHuman Genetics杂志上发表文章Bi-allelic DNAH8Variants Lead to Multiple Morphological Abnormalities of the Sperm Flagella and Primary Male Infertility，鉴定了新的弱畸精子症致病基因DNAH8。该基因的双等位突变导致的男性不育或可通过ICSI获得良好的妊娠结局。
该研究通过全外显子测序技术结合高效的生物信息学分析方法对来自国内多个研究中心的90个无血缘关系的汉族男性MMAF病例进行了遗传分析。研究发现了2例（2.2%）MMAF患者同时携带有DNAH8基因的双等位突变（图1A， 1B）。这两个来自非近亲家系的患者（A051II-1和X003 II-1）分别携带有DNAH8基因上（c.11771C>T [p.Thr3924Met]和c.6689A>G [p.Lys2230Arg]）及（c.9427C>T [p.Arg3143Cys]和c.12721G>A [p.Ala4241Thr]）的复合杂合突变。Sanger 验证分析表明这些位点分别遗传自他们携带杂合突变的父母，符合MMAF隐性遗传模式。生物信息学分析表明所有这些突变位点都是罕见的并且均具有较强的致病性（表1）。此外，通过畸形精子症的国际协作研究，对来自北非、伊朗以及法国的167个MMAF病例进行全外显子测序分析，研究者同时发现了一个来自摩洛哥近亲家系的MMAF患者携带有DNAH8的纯和致病性突变（c.6962_6968del [p.His2321Profs*4]）（图1C）。这一位点的变异导致了后续氨基酸序列的改变以及终止密码子的提前。同时，保守型分析也表明所有的这3个病例携带的突变位点在不同物种间是高度保守的（图1D）。
表1.畸形精子症病人中鉴定到的DNAH8突变位点信息
对携带有DNAH8突变的病例进行精子活力及形态学分析发现，DNAH8缺陷患者的精子活力明显降低、尾部鞭毛呈现出典型的MMAF的表型，包括外部形态的多种畸形以及内部超微结构的异常（图2，图3）。为进一步探究DNAH8基因突变与精子形态活力的相关性，该研究过CRISPR-Cas9技术构建了Dnah8敲除小鼠模型。
图2 正常男性的精子（A, F）和DNAH8基因缺陷男性的精子外部形态（B-E, G-J）
图3 正常男性的精子（A, B）和DNAH8基因缺陷男性的精子内部超微结构（C-F）
进一步表型分析发现Dnah8基因敲除的雄性小鼠同样表现出典型的MMAF表型以及生育力障碍（图4）。
图4 杂合突变对照小鼠的正常精子和Dnah8基因敲除小鼠的精子外部形态（A）及超微结构（B）
此外，雄性小鼠睾丸和附睾的HE染色分析发现Dnah8基因敲除导致精子发生异常（图5）。因此，DNAH8基因的双等位突变是导致MMAF相关表型以及生育力障碍的重要致病因素。
图5 杂合突变对照小鼠和Dnah8基因敲除小鼠的睾丸（A）和附睾（B）HE染色
作为一种高度保守的细胞器，动态纤毛和鞭毛是细胞运动和信号转导所必须的。它们所共有的轴丝结构为典型的“9+2”模式，也即9对外周二联体微管和1对中央微管。除了轴丝，在鞭毛结构中还包括规律地排列在外周微管周围的多样化的附属结构。其中，外动力臂借助锚定蛋白附着于微管，通过ATP水解提供纤毛或鞭毛摆动的动力。先前的研究已经报道了一系列的导致纤毛或鞭毛类疾病的外动力臂相关蛋白，包括DNAH5，DNAH11以及DNAI1等。该研究中，动力臂相关蛋白DNAH8的缺陷不仅诱发精子形态异常及生育力障碍，同时也导致另一个外动力臂相关蛋白DNAH17在精子尾部定位异常（图6）。与此一致的是，先前的一项关于DNAH17基因突变导致精子形态异常的研究中同样发现了DNAH17蛋白的缺陷同样的导致了DNAH8在尾部的定位异常。由此可见，DNAH8与DNAH17这两个外动力臂相关蛋白可能以一种协同依赖的方式参与精子发生以及尾部鞭毛的组装。
图6 正常男性的精子和DNAH8基因缺陷男性的精子中DNAH8及DNAH17蛋白定位
在临床实践中，卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）技术使不孕不育患者的受孕成功率大幅提高。现阶段，对于MMAF这一类疾病的治疗同样主要依赖于ICSI技术。然而，在先前的基础研究以及临床治疗中发现，携带不同遗传变异的病人通过ICSI干预获得的临床妊娠结局是不同的。因此，探究不同遗传背景下ICSI结局就显得尤为重要。该研究中，基于CRISPR-Cas9技术构建的Dnah8基因敲除小鼠模型，研究者们对基因编辑的小鼠进行了ICSI干预实验并对形成的2-细胞进行了移植。结果表明，利用Dnah8基因敲除小鼠的精子进行ICSI干预后可以获得成熟的2-细胞胚胎，经胚胎移植后可获得杂合的幼鼠（图7）。与此一致的是，该研究中携带DNAH8纯和致病突变的摩洛哥病例在临床上也接受了ICSI干预治疗并且获得了良好的妊娠结局。因此，DNAH8基因的双等位突变导致的弱畸精子症可以通过ICSI干预获得良好的妊娠结局。
图7 Dnah8基因敲除小鼠的精子可以通过ICSI辅助生殖技术（A）获得后代（B-C）
综上，该研究基于全外显子测序技术以及高效的生物信息学分析方法从来自国内外不同地区的多个MMAF病例中鉴定了新的弱畸精子症致病基因DNAH8。DNAH8基因的双等位突变导致的男性不育或可通过ICSI获得良好的妊娠结局。该研究成果的取得将为弱畸精子症的遗传咨询、分子诊断以及个性化治疗方案的确立提供理论支持。据悉，复旦大学教授张锋和日本大阪大学教授伊川正人为该论文的共同通讯作者。复旦大学的刘春雨、唐淑妍，日本大阪大学的宫田治彦、XU Zoulan，安徽医科大学的高阳，厦门大学的沙艳伟为该论文的共同第一作者。安徽医科大学曹云霞教授、法国格勒诺布尔大学Pierre Ray教授、巴黎大学Aminata Touré教授为共同资深作者。
