21世纪以来，全球不孕不育发病率逐年升高，已影响10%-15%的育龄夫妇。WHO将不孕不育与心血管疾病、肿瘤列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。其中男性不育约占40%-50%。男性不育常表现为少精子症，弱精子症，畸精子症或者多种组合形式，弱畸精子症是其中最常见类型之一，但是目前多数患者准确的病因未明。
精子鞭毛多发形态异常（Multiple Morphological Abnormalities of the Flagella,MMAF）是一类严重的弱畸精子症，由于短尾、卷尾、无尾、折尾及不规则尾等精子鞭毛的多种畸形导致精子活动能力和受精能力严重下降【1】。目前的研究提示MMAF的病因多数与基因变异密切相关。本课题组是目前国际上研究弱畸精子症的主要团队之一，前期报道了多个导致MMAF的致病基因，如精子鞭毛轴丝相关基因CFAP43、CFAP44、CFAP65【2,3】，鞭毛纤维鞘发育相关基因FSIP2【4】，纤毛和鞭毛组装过程中的蛋白转运相关基因CFAP69、TTC21A、TTC29【5-7】和精子中心体相关基因DZIP1【8】等。然而，由于精子结构复杂，涉及的蛋白种类繁多，目前，仍有30%-40%的MMAF 患者遗传病因尚未明确。因此，MMAF的遗传学病因和致病机理仍需进一步探索。
2020年8月12日，安徽医科大学校长、国家卫健委配子与生殖道异常研究重点实验室主任曹云霞教授和复旦大学张锋教授以长文形式在The American Journal of Human Genetics杂志上发表题为：Bi-allelic Loss-of-function Variants in CFAP58 Cause Flagellar Axoneme and Mitochondrial Sheath Defects andAsthenoteratospermia in Humans and Mice研究，发现并鉴定了弱畸精子症新的致病基因CFAP58，该基因的双等位突变通过影响精子鞭毛轴丝和线粒体鞘组装而导致男性不育和雄性小鼠不育。
该研究通过全外显子测序技术结合高效的生物信息学分析方法对来自安徽医科大学第一附属医院和南京医科大学第一附属医院的90例汉族男性MMAF患者进行了基因检测和遗传学分析。发现了5例（5.6%）MMAF患者同时携带有CFAP58基因的双等位突变，其中来自近亲家系A050、N010、N011患者和散发家庭N015患者，分别携带CFAP58基因c.2092C>T(p.Arg698*)、c.2052del (p.His685Thrfs*7)，c.1696C>T (p.Gln566*)和c.2274C>A(p.Tyr758*)的纯合突变，来自散发家庭A064患者携带c. 2092C>T (p. Arg698*) / c.1429del (p.lle477*)复合杂合突变。Sanger测序进行家系共分离验证，证明这些突变位点分别遗传自他们携带杂合突变的父母（图1A），符合MMAF隐性遗传模式。这些突变位点均为功能缺失突变位点，由于出现提前出现终止密码子（表1），无法翻译合成完整CFAP58从而导致蛋白质功能损害。同时，保守型分析也表明本研究中5个突变位点在不同物种间是高度保守的（图1B）。
图1. CFAP58基因突变位点鉴定及保守性分析
CFAP58基因突变患者精子可以表现为无尾，短尾，卷尾，折尾和不规则尾等，进一步统计发现5例患者均以短尾和卷尾为主（图2A）。精子免疫荧光染色和免疫印迹实验发现，正常精子中CFAP58主要定位在精子鞭毛，而CFAP58突变患者精子CFAP58蛋白表达缺失（图2B和2C）。
图2. 正常对照和CFAP58基因突变患者精子形态及CFAP58的定位与表达
利用透射电镜技术发现，与正常对照精子相比CFAP58基因突变患者80%以上精子轴丝组装显著异常，包括中央二连管缺失、外周微管缺失或微管排列紊乱等（图3A和B）。进一步精子免疫荧光染色和免疫印迹实验发现，中央二连管标志蛋白SPAG6和SPEF2均显著降低（图3C和D）。
图3. CFAP58基因突变与精子轴丝组装异常相关
另外，精子纵切面透射电镜检测发现，CFAP58基因突变患者精子鞭毛中段线粒体鞘发育异常，表现为鞭毛中段线粒体鞘排列紊乱或长度变短，外周致密纤维数量增多（图4A和图3A），进一步精子免疫荧光染色和免疫印迹实验发现线粒体伴侣蛋白HSP60表达显著降低（图4B和C）。
图4. CFAP58基因突变与精子线粒体鞘发育异常相关
为了进一步检测CFAP58在小鼠精子鞭毛发生过程中的作用，利用CRISPR-Cas9技术构建Cfap58基因敲除小鼠模型。小鼠相关实验发现Cfap58基因敲除小鼠睾丸中CFAP58蛋白表达缺失，雄性小鼠完全不育，尽管睾丸的重量和体积未发生变化，但是Cfap58基因敲除小鼠精子浓度显著降低，精子活力几乎为零，精子形态表现为典型的MMAF表型（图5），与CFAP58基因突变患者精子表型高度一致。
综上所述，该研究基于全外显子测序技术从来自国内多个生殖中心的90例MMAF患者中鉴定了新的弱畸精子症致病基因CFAP58。该基因的双等位突变引起精子鞭毛轴丝和线粒体鞘组装异常而导致男性不育。这一结果得到Cfap58基因敲除小鼠的验证，该研究成果的取得将为弱畸精子症的遗传咨询、分子诊断和临床治疗提供重要理论依据。
图5. Cfap58基因敲除小鼠表现典型的MMAF表型
安徽医科大学曹云霞教授和复旦大学张锋教授为该论文的共同通讯作者。安徽医科大学第一附属医院的贺小进副教授，吕明荣副教授，倪小晴博士和李强硕士研究生，复旦大学的刘春雨博士和南京医科大学第一附属医院的杨晓玉副主任医师为该论文的共同第一作者。
