人卵母细胞（卵子）冷冻保存是女性生育力保存的重要组成部分，在生殖医学领域具有极其重要的应用价值。人卵子低温保存技术可以为因卵巢早衰、盆腔疾病、肿瘤进行手术或放、化疗等可能丧失卵巢功能的女性解决生育问题，同时也会促进人类卵子库的建立。冷冻保存会对人卵子造成不可逆的损伤，严重损害冻融后卵子的发育能力，这是阻碍人类卵子冻存技术常规开展的重要障碍。动物研究显示褪黑素作为一种高效、安全的细胞保护剂，可以有效抑制卵子在冻融过程中所遭受的冷冻损伤，进而明显改善冻融后卵子的发育。基于此，褪黑素对人类卵子在冻融过程中是否也存在类似的保护作用？鲜有研究。
2020年12月3日，来自安徽医科大学的曹云霞教授团队首次在Journal of Pineal Research上在线发表了题为“Melatonin improves the effect of cryopreservation on human oocytes by suppressing oxidative stress and maintaining the permeability of the oolemma”的关于人类卵子低温冷冻保存的研究性文章。本研究深入探索了褪黑素在人类卵子冻存过程中作为玻璃化冻融液添加剂可以有效抑制氧化应激以及维持卵母细胞膜的通透性，从而显著改善人卵母细胞的冻存效果，为建立一种安全高效的人卵母细胞冻存技术体系提供了技术和理论基础，也是女性生育力保存和人卵母细胞冷冻保存技术的一次重要突破。
在前期的研究中，曹云霞教授课题组已经建立了一套应用褪黑素体外培养COH周期中人未成熟卵母细胞获得了大量优质体外成熟人卵母细胞的IVM技术体系（Zou H, Chen B, Ding D, Gao M, Chen D, Liu Y, Hao Y, Zou W, Ji D, Zhou P, Wei Z, Cao Y and Zhang Z. Melatonin promotes the development of immature oocytes from the COH cycle into healthy offspring by protecting mitochondrial function, Journal of Pineal Res, 2020, 68(1): e12621.），解决了人卵母细胞冷冻保存研究材料不足的问题。在本次研究中，课题组将体外培养成熟的人卵子随机分为新鲜组、褪黑素处理冷冻保存组(MC)和无褪黑素处理冷冻保存组(NC)，随后通过玻璃化冷冻和复温后，对这三组冻融后卵母细胞的线粒体功能、超微结构、卵子质膜通透性、早期凋亡、发育潜力以及耐低温相关基因和蛋白的表达进行了系统性检测和分析。
在本次研究中，首先，通过在冷冻液和解冻液中分别添加不同浓度(10−11, 10−9, 10−7和10−5M)的褪黑素冻融人卵母细胞，随后检测线粒体膜电位（MMP）水平、氧化应激产物活性物质（ROS）含量及卵子胞内 Ca2+水平以分析不同浓度褪黑素对人卵母细胞线粒体功能的影响，筛选出在冷冻保存过程中10-9M是褪黑素保护人卵母细胞线粒体功能的最佳添加浓度。
超微结构在卵母细胞冻存过程中极易遭受不可逆的损伤。本研究利用电子显微镜检测了人卵母细胞超微结构变化，结果表明，在冻融过程中添加10-9M褪黑素可以很好地保护卵母细胞的超微结构（包括线粒体、皮质颗粒、微绒毛和空泡），提示褪黑素的添加可以有效减轻冷冻导致的卵母细胞损伤。卵子冻融过程的本质是细胞内水分与细胞外渗透性保护剂（CPA）相互置换的过程，而介导这一水-质跨膜交换的细胞器为卵细胞膜，如果在玻璃化冻融过程中不能有效地维护卵细胞膜的通透性功能，卵细胞内外形成冰晶将是不可避免的，将直接损害卵细胞膜及卵子内部的亚细胞器结构，甚至导致冻融后卵子的直接死亡。本研究中卵细胞膜通透性实验结果表明，褪黑素可以有效地维护卵子在冻存过程中质膜的结构完整和渗透性功能。
本研究中，课题组发现冷冻保存加重了冻融后人卵母细胞早期凋亡的程度，大大降低了其发育能力，而褪黑素的添加显著逆转了这一不利结果，特别是冻融后卵子的早期凋亡率显著降低(P<0.01)，受精后，此类卵子的分裂期优质胚胎率及囊胚形成率显著增加(P<0.05)。研究结果表明，褪黑素的作用能有效改善人卵母细胞冷冻保存的效果。
最后，为了进一步系统分析褪黑素在提高人卵母细胞冷冻保存效果方面的作用机制，本研究采用单细胞RNA测序（sc-RNA）和免疫荧光技术对上述三组人卵母细胞中的相关抗冻基因进行筛选和分析，并检测其蛋白表达。结果发现褪黑素可以阻止玻璃化冷冻对人卵母细胞冷冻保存过程中AQP1蛋白表达的抑制作用。据报道，在生物进化过程中，维持细胞内水-质交换平衡主要是由水通道蛋(aquaporins，AQPs)完成的。AQP1被归类为AQP的一个亚型，它只对水的渗透进行调节，即使在较低的温度下，AQP1也能以通道介导的方式促进水在卵细胞膜上的传输。因此，课题组推测褪黑素可能通过抑制冻融过程对AQP1蛋白的损伤，很好维护了卵细胞膜的通透性功能，从而有效抑制了冻融过程中大冰晶的形成，进而有效避免了冷冻损伤，最终显著改善了冻融后卵子的发育。
综上所述，本研究系统阐明了褪黑素可以通过抑制氧化应激和维持卵母细胞通透性以显著提高人卵母细胞冻存效果。这一技术体系为人类卵子库的建立提供了基础，是人类辅助生殖技术领域的一次重要突破。
本研究是曹云霞教授领导的安徽医科大学第一附附属生殖医学团队的又一项重要研究成果。章志国副教授、穆耀琴硕士生、丁丁硕士，以及邹薇薇博士生为共同第一作者，曹云霞教授、魏兆莲教授、周平副教授以及邹慧娟博士为本次研究的通讯作者。
