精子顶体蛋白酶ACROSIN缺乏阻止精子穿越卵子透明带导致受精失败
与全受精障碍（total fertilization failure, TFF）相关的精子缺陷具有很强的隐蔽性。这类患者看似正常或轻度异常的精液参数容易误导临床诊疗方案的制定，进而导致患者接受不必要的临床检查和药物治疗，给这些夫妇带来了巨大的经济负担和心理创伤。因此，了解精子缺陷相关TFF的遗传学基础具有重要的临床意义。
2023年6月1日国际生殖医学研究领域权威学术期刊《人类生殖》（Human reproduction, IF=6.1）在线发表《Human Reproduction Update中文版》副主编、安徽医科大学曹云霞教授/吴欢副教授/贺小进教授/花荣副教授团队的研究（《ACROSIN deficiency causes total fertilization failure in humans by preventing the sperm from penetrating the zona pellucida》）。该研究发现睾丸特异性表达的顶体蛋白酶基因ACR的罕见突变。该突变导致突变精子头部的ACROSIN蛋白缺乏和顶体的超微结构缺陷，进而导致精子无法穿越卵子透明带，从而引起TFF和不育。随后，团队利用透明带下授精（Subzonal insemination, SUZI）和单精子卵胞浆注射（ICSI）的方式成功获得受精卵。这表明无需辅助性卵母细胞辅助激活（assisted oocyte activation, AOA）的ICSI治疗是ARCOSIN缺失型TFF的最佳助孕方案。该研究扩大对精子缺陷相关TFF的遗传变异的理解，并为这类患者的精确诊疗提供理论依据[1]。
聚焦临床现状确立研究方向
在哺乳动物的受精过程中，精子穿透卵母细胞周围的透明带（zona pellucida, ZP）是关键步骤之一。ACROSIN，一种由ACR基因编码的丝氨酸蛋白酶，主要在精子头部的顶体区域表达。先前的研究表明，ACROSIN活性的抑制会阻止精子穿透ZP，导致多种物种（包括人类）的受精失败[2]。尽管在仓鼠中已经证实了ACROSIN在精子穿透ZP中的必要性[3]，但迄今为止，尚未在人类中发现与ACROSIN相关的TFF病例。本研究通过全外显子组测序（WES）技术，对经历体外受精（IVF）或单精子胞浆内注射（ICSI）失败的八对夫妇进行了基因检测。研究结果发现，在两个近亲结婚家庭的兄弟中，存在一种新的ACR基因纯合无义突变（c.167G>A, p.Trp56X），这种突变导致了ACROSIN的缺乏和精子顶体的超微结构缺陷。这些精子无法穿透ZP，而不是影响精子结合、配子融合或卵母细胞激活。通过亚透明带内注射（SUZI）和IVF实验，进一步证实了ACROSIN缺陷导致的TFF的确切病理机制。研究还指出，ICSI无需补救性辅助卵母细胞激活即可成功实现受精，表明ICSI是治疗ACROSIN缺陷相关TFF的最佳方法。本研究的发现不仅扩展了我们对人类TFF相关基因的理解，而且为这些患者的遗传咨询和生育指导提供了重要信息[4]。
严谨设计方法创新
本研究通过全外显子组测序（WES）技术，对8对经历体外受精（IVF）或单精子胞浆内注射（ICSI）失败的不孕夫妇进行了基因检测，以识别导致男性因素TFF的致病基因。研究首先从参与者的外周血中提取DNA，然后进行外显子捕获和测序。测序数据经过质量控制和比对后，使用生物信息学工具进行变异注释，特别关注无义突变和移码插入/缺失。通过Sanger测序验证了候选突变。此外，研究还包括精液分析，评估了精子的常规参数，并通过电子显微镜技术对精子的超微结构进行了详细观察。为了进一步验证ACROSIN蛋白的表达，研究团队运用了免疫荧光染色和西方印迹技术。通过IVF和亚透明带内注射（SUZI）实验，研究团队观察了ACROSIN缺陷精子与卵母细胞的相互作用，证实了这些精子无法穿透透明带，从而导致TFF。研究结果表明，ICSI是治疗ACROSIN缺陷相关TFF的有效方法，为相关不育症患者的治疗提供了新的策略。
细致分析科学求证
1. 人类完全受精失败的新致病变异：ACR基因的纯合无义突变
采用全外显子组测序在8对夫妇中鉴定男性因素在TFF的致病基因。在两个不相关的TFF患者中（P3和P5）检测到PLCZ1基因纯合无义变异（c.588C>A, p.Cys196X），在另一位患者中（P4）检出ACTL7A基因的两个复合杂合变异(c.733G>A:p.Ala245Thr, c.737G>C:p.Gly246Ala)。此外，研究人员在两个来自近亲结婚家庭的兄弟（P1和P2）中检出ACR基因的纯合无义变异(c.167G>A, p.Trp56X)，而此前未有在人类ACR基因中鉴定到致病变异的报道出现。另外的三个TFF患者则未检出疾病的可能相关变异。
经Sanger验证发现先证者P1和P2的纯合变异来自于携带杂合变异的父母（见图1A）。罕见变异c.167G>A位于ACR基因第二号外显子上，使一个进化上保守的氨基酸变为终止密码子，导致蛋白表达提前终止，可能破坏蛋白表达（见图1B）。P1和P2精子的大体形态和参数是正常的，两位先证者的女性配偶的生殖系统常规检查显示正常。考虑到两位丈夫看似“正常”的精子，这对夫妇计划在不同的医院进行试管婴儿，以克服他们无法解释的不孕。两对夫妇首次IVF尝试时出现TFF，未受精的卵母细胞在IVF失败后进行4小时补救性ICSI（R-ICSI），以恢复受精，R-ICSI后各自的受精的发生率分别为93.8%和83.8%。在移植一个囊胚后，在两对夫妇都建立了单胎妊娠。
图1 ACR变异家系图谱和突变致病性验证
2. ACR c.167G>A突变引起精子顶体的顶体蛋白酶缺乏和超微结构缺陷
为了研究ACR c.167G>A突变的致病性，课题组在正常精子和突变型精子中研究了ACROSIN蛋白的丰度并评估了各自的顶体超微结构。Western蛋白印迹实验表明，ACR c.167G>A精子细胞中ACROSIN蛋白完全没有表达（此前推测可能会表达截短的异常蛋白），而在正常对照样品中ACROSIN的46kDa蛋白带是明显的（图1C）。这一发现与我们的实验结果完全一致，顶体ACROSIN免疫染色在先证者IV-1检测不到信号，而在对照精子的顶体中相应的信号是明显的（图1E）。
精子体外培养过程中不断发生自发顶体反应，这可能导致一些顶体蛋白的损失。将正常精子细胞分别在体外暴露1-4小时后，课题组提取不同暴露时长下的精子ACROSIN检测其稳定性。免疫印迹实验表明所有组别ACROSIN条带在46kDa处保持恒定（图1D），表明正常精子在体外暴露一定时间仍可维持稳定状态。这证实了在患者中ACROSIN的表达缺陷是由于ACR c.167G>A突变所致，而不是体外自发降解。尽管ACR c.167G>A精子在光学显微镜和扫描电镜下呈现正常精子形态（图2A–C），透射电镜分析揭示了其精子头部典型的超微结构缺陷。与正常情况精子细胞相比，约75%受影响精子的顶体从核被膜上脱离，呈现折叠和脱落状态，且疏松的核周膜呈现不规则增厚（图2D&2E）。这些结果共同表明这种新的突变是有害的，能减少精子中ACR的表达并扰乱精子顶体锚定过程。
图2 透射电镜和扫描电镜下精子超微结构以及蛋白印迹实验
3. 顶体蛋白酶缺乏不影响ACTL7A或PLCζ的表达
为了确认ACROSIN缺乏是否会影响两个其他受精相关蛋白（ACTL7A和PLCζ）的表达和丰度，课题组在ACR c.167G>A精子中研究了这些头部原件的表达情况，ACTL7A-和PLCζ-免疫染色信号均正常分布于ACR c.167G>A精子头部顶体和/或赤道区域（图2F），且突变型精子的ACTL7A和PLCζ蛋白水平与正常精子一致（图2G）。这些发现表明ACROSIN和ACTL7A或PLCζ之间并无关联。这表明由ACROSIN缺乏导致的TFF与ACTL7A或PLCζ缺陷非常不同，后者需要辅以卵母细胞人工激活（Artificial oocyte activation, AOA）才能完成受精。
4. 顶体蛋白酶缺乏阻碍了精子穿透透明带
为了证实ACROSIN对人类精子与透明带的相互作用至关重要，正如之前在仓鼠中发现的那样，课题组分别使用正常的精子和ACR167G>A精子进行IVF试验。18h IVF操作后，同之前失败的IVF结果一样，ACR167G>A精子无法使完整的卵丘卵母细胞受精。在授精18h后移除卵丘卵母细胞，课题组发现ACROSIN缺陷型精子不仅无法穿透透明带，而且甚至无法与之结合。相反，正常对照精子成功地使卵母细胞受精，并且观察到其他几个精子的头部被卡在透明带中，这表明在受精完成之前，被卡住的精子已经穿透但尚未穿过透明带（图3A）。根据目前的观察结果，ACR167G>A精子无法附着在透明带上有两个可能的原因：卵母细胞卵丘细胞去除过程中产生的机械剥离力或ACROSIN缺乏本身影响。为了确认这一点，课题组在体外用ACR167G>A突变精子对没有卵丘细胞的卵母细胞进行授精。尽管授精18小时后卵母细胞仍未受精，但大量ACR167G>A精子成功附着在透明带表面，这一现象说明ACROSIN缺乏不是ACR167G>A精子无法附着在透明带上的原因（图3B）。这一现象说明人类ACROSIN蛋白在精子穿透而并非附着透明带过程中起作用，这一观察与仓鼠中Acr敲除的表现一致。
图3 ACR缺陷型精子和正常精子在不同体外受精过程中的表现
5. 由顶体蛋白酶缺乏导致的TFF能被ICSI或SUZI拯救而成功受精
为了进一步确认先证者IVF过程中TFF事件发生的原因（透明带穿透？配子融合？卵母细胞激活？），研究组对先证者的精子进行了SUZI试验。通过透明带后，ACR167G>A精子注射到三个M II卵母细胞的卵周间隙（而不是直接注射到卵核中），最后ACR167G>A精子成功与卵母细胞融合，且在没有进行补救AOA的情况下受精，最终由此产生的受精卵在体外发育顺利培养成高质量的囊胚（图3C）。后续对所有的囊胚进行基因型分析发现都为ACR167G>A突变携带者，表明它们确实一部分来源来自突变精子，而非孤雌生殖胚胎。以上发现，结合两对突变夫妇的未受精卵母细胞可通过ICSI有效挽救IVF失败结果的案例，表明透明带穿透失败是影响ACROSIN缺乏精子无法使卵母细胞受精的唯一因素。更重要的是，对于这些患者来说，ICSI是最佳治疗方式。
结果剖析回归临床
本研究首次发现了携带ACR纯合无义突变不育患者，这两个不育兄弟在试管婴儿尝试过程中遭遇了TFF。一系列研究表明，这种罕见的LOF突变导致受影响精子中的ACROSIN缺乏和顶体分离，是由于精子透明带穿透受阻而导致男性因素影响的TFF。鉴于在SUZI或ICSI尝试后ACR167G>A精子能成功受精，且突变精子中ACTL7A和PLCζ表达正常，课题组认为治疗ACROSIN缺乏引起的TFF，ICSI是最佳方案且不需要AOA进行补救。该研究发现扩大了我们对人类TFF相关基因的理解，有助于对类似患者提供合适的遗传咨询以及生育指导。
回顾研究展望未来
本研究在揭示ACROSIN基因突变与人类完全受精失败（TFF）之间的联系方面取得了初步成果，但受限于较小的样本量和缺乏多中心验证，其普遍适用性和结果的确定性有待加强。未来的研究需扩大样本范围，涵盖更多种族和地理背景的不孕夫妇，并通过多中心合作来验证ACR基因突变的关联性。此外，深入探究ACROSIN在精子穿透过程中的作用机制，以及其与其他生殖蛋白的相互作用，将有助于揭示TFF的复杂遗传背景。同时，开发和应用体内实验模型，以更准确地模拟和理解生殖过程中的分子事件，对于验证体外实验结果和指导临床治疗具有重要意义。这些研究将为TFF患者提供更精确的遗传诊断，推动个性化治疗策略的发展。
参考文献：
1. Hua R, Xue R, Liu Y, Li Y, Sha X, Li K, Gao Y, Shen Q, Lv M, Xu Y et al: ACROSIN deficiency causes total fertilization failure in humans by preventing the sperm from penetrating the zona pellucida. Hum Reprod 2023, 38(6):1213-1223.
2. Primakoff P, Myles DG: Penetration, adhesion, and fusion in mammalian sperm-egg interaction. Science 2002, 296(5576):2183-2185.
3. Kashir J, Ganesh D, Jones C, Coward K: Oocyte activation deficiency and assisted oocyte activation: mechanisms, obstacles and prospects for clinical application. Hum Reprod Open 2022, 2022(2):hoac003.
4. Liu DY, Baker HW: Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biol Reprod 1993, 48(2):340-348.
通讯作者：
曹云霞，医学博士，主任医师，二级教授，博士生导师，安徽医科大学妇产科学系主任。国家卫健委配子与生殖道异常研究重点实验室主任，教育部生命资源保存与人工器官教育部工程研究中心主任，安徽省生育力保存与人工器官工程技术研究中心主任，生殖健康与遗传安徽省重点实验室主任，安徽省“115”产业创新团队负责人，安徽省学术技术带头人。妇幼健康研究会生殖医学专委会主任委员，中国医师协会生殖医学专委会副主任委员，中国医师协会遗传学分会副会长。享受国务院特殊津贴，国家卫生健康突出贡献中青年专家，全国优秀科技工作者。主持包括国家重大基础研究计划、国家新药创制重大项目、国家自然基金项目等国家级和省级课题40余项。“2014年度中国十大科学进展”获得者。先后获得省科技进步一等奖3项，中国妇幼健康科技奖一等奖2项。发表包括《Cell》、《Nat Genet》、《The Lancet》、《N Engl J Med》、《Am J Hum Genet》、《Advanced Science》等SCI收录论文200余篇。安徽省科协副主席（兼）。
吴欢，医学博士，硕士生导师，安徽医科大学第一附属医院副主任医师。安徽省第一届卫生健康骨干人才和安徽省教育厅高校优秀青年骨干人才。研究方向：配子发生异常的遗传学病因及其致病机制研究。主持国家自然基金青年项目1项，省级科研课题3项以及校级科研课题2项。作为主要完成人获2021年全国妇幼健康科学技术奖一等奖1项。以第一作者或通讯作者（含共同）发表包括《America Journal of Human Genetics》、《Cell Death & Disease》、《Science China Life Sciences》和《Human Reproduction》等SCI收录论文20余篇。
贺小进，主任医师，教授，上海交通大学博导，博士后合作导师。上海市第一人民医院生殖医学科主任，国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室特聘教授。兼任中国医师协会生殖医学专委会青委会副主委，中国康复医学会生殖医学专委会常委等学术任职。长期从事生殖医学临床工作和生殖遗传与环境病因学基础研究。国家重点研发计划子课题课题组长，主持国自然面上项目3项。以通信/第一作者在《Nature Communications》、《America Journal of Human Genetics》、《JAMA Network Open》、《Nucleic Acids Research》、《eBioMedicine》等国际著名学术期刊发表SCI论文50余篇。研究成果被OMIM数据库引用17次，成为人类遗传数据的重要组成部分。作为主要完成人获全国妇幼健康科学技术奖一等奖2项，安徽省科学技术进步奖一等奖1项，中国出生缺陷干预救助基金会科学技术奖-青年学者奖获得者。
花荣，生殖医学博士，硕士生导师，安徽医科大学国家卫生健康委配子与生殖道异常研究重点实验室副研究员，安徽省优秀青年基金获得者（2022年）。研究方向：1，男性不育与精子发生的机制；2，受精及胚胎发育的男性因素研究；3，精子的表观遗传对胚胎发育及子代健康的调控机制。主持国家自然科学基金2项。以（共同）第一或通讯作者在《Nucleic Acids Research》、《PNAS》、《Science China Life Sciences》、《Human Reproduction》、《Human Molecular Genetics》等期刊发表SCI论文多篇。《Cellular and Molecular Life Sciences》、《Journal of Human Genetics》等杂志专业审稿人。
