鞭毛轴丝内动力蛋白臂轻中链蛋白DNALI1缺乏破坏鞭毛内动力蛋白臂和纤维鞘的组装
导致人和小鼠严重弱精子症和不育
2023年2月15日自然出版集团下属的权威医学生命科学期刊《细胞死亡及疾病》（Cell Death & Disease, IF=9.1）在线发表了《Human Reproduction Update中文版》副主编、安徽医科大学曹云霞教授/贺小进教授/花荣副教授/吴欢副教授团队的研究（DNALI1 deficiency causes male infertility with severe asthenozoospermia in humans and mice by disrupting the assembly of the flagellar inner dynein arms and fibrous sheath）。该研究基于特发性男性弱精子症（asthenospermia, AZS）的临床家系，采用全外显子组测序联合基于CRISPR/Cas9技术构建小鼠同源基因敲除模型的研究策略。研究结果阐述人、鼠弱精子症的新致病基因DANLI1通过调控精子鞭毛纤维鞘和轴丝内动力蛋白臂的组装来维护鞭毛的完整结构和正常的运动功能。此外，通过单精子卵胞浆注射（ICSI）辅助生育技术，DANLI1突变患者成功获得子代。该研究增加研究人员对特发性AZS发病机制的理解，并为这类患者的精确诊疗提供理论依据。
临床发现：鞭毛轴丝内动力蛋白臂轻中链基因DNALI1是人弱精症潜在新致病基因
本研究通过WES在一例AZS先证者的基因组发现了DNALI1基因的纯合移码缺失突变。该突变导致先证者精子内的DNALI1蛋白完全缺失（图1C-D）。精液检查显示该患者的精子活力丧失，但鞭毛的外观形态大体正常（图1E）。因此，该先证者被定义为单纯性弱精子症患者。
DNALI1缺失的患者精子鞭毛的FS结构异常。正常人精子的鞭毛，从精子头部出发，由近及远分为三个组分：中段、主段和尾端。在透射电子显微镜下，正常精子主段的外周通常由一层致密的纤维鞘包裹。该结构含有两条平行于鞭毛轴丝的LC结构。LC结构在鞭毛中主段中的位置是固定的，分别与FS内部的#3和#8号外周致密纤维（ODF）的位置相对应。该结构在物理性质上属于鞭毛组分中的刚性结构，对于微管的滑动、鞭毛的摆动幅度和角度起着至关重要的作用。不同于正常人的精子，该患者精子主段的FS结构出现了明显的结构异常现象，表现为LC位置的紊乱（图1F-G）。此外，FS的标记蛋白AKAP4的表达量显著降低，提示了先证者精子FS功能的异常（图1H-I）。
图1. DNALI1缺失精子的形态学检查。A-B. DNALI1缺失突变患者的家系图谱及Sanger测序验证；C. DNALI1在先证者精子中完全缺失；D. DNALI1定位于正常精子的鞭毛，而先证者的精子中完全缺失；E. 先证者精子的形态大体正常；F-G.先证者精子FS结构的LC定位异常；H.先证者精子的AKAP4表达量显著减少；I.先证者精子的FS蛋白GAPDHS表达量正常。
DNALI1是IDA的轻重链，是重链组分与微管蛋白相互连接的媒介。动力蛋白臂，分为外动力蛋白臂（ODA）和内动力蛋白臂（IDA），是调节鞭毛微管滑动的动力装置，是精子鞭毛摆动的结构基础。IDA分为7种亚型，分别由不同的重链（DHC）、中链（IC）、轻链（LC）及少数轻中链（LIC）组成。其中，IC和LIC作为媒介，是DHC连接微管的结构基础。免疫荧光检测显示，DNALI1作为LIC蛋白，它的缺失会导致多种DHC组分的缺失（图2）。因此，在IDA组分不全的情况下，先证者的精子动力缺失，进而导致精子运动功能障碍。
图2. DNALI1缺失导致IDA组分缺失。A. 人精子鞭毛IDA的结构模式图及DNALI1的亚细胞定位；B-G. DNALI1的缺失导致DNAH1和DNAH12的缺失，而其它多种DHC及鞭毛组分蛋白的定位正常。
DNALI1缺失导致小鼠精子运动功能障碍和鞭毛FS不对称。基因敲除动物验证基因突变致病的重要工具。该研究，通过CRISPR-CAS9技术构建了Dnali1敲除小鼠（Dnali1-/-）。该小鼠雄性完全不育，精子产量下降，运动能力显著缺失（图3）。在透射电镜下，Dnali1-/-小鼠精子FS结构的IC排列紊乱，DNAH1和DNAH7等DHC蛋白缺失（图4）。以上发现结果与先证者完全一致，进一步明确了DNALI1蛋白缺失可导致精子的结构与形态异常。
图3. DNALI1缺失小鼠精子运动力下降、雄性不育。A-B. Dnali1-/-小鼠的睾丸及附睾组织未见显著形态异常；C. DNALI1缺失导致小鼠精子的活力缺失；D-E.Dnali1-/-小鼠精子的形态未见显著异常；F. Dnali1-/-小鼠睾丸内的精子发生过程未见显著异常；G. Dnali1-/-小鼠附睾尾部的精子产量未见显著下降。
图4. Dnali1-/-小鼠精子FS不对称，IDA组分缺失。A-B. Dnali1-/-小鼠精子主段FS的IC结构不对称；C-F. Dnali1-/-精子的DNAH1和DNAH7蛋白组分缺失。
DNALI1蛋白定位于圆形精子细胞的胞质，调节鞭毛组分的组装。在精子变形阶段，DNALI1和DNAH1均表达于圆形精子的细胞质（图5A-C）。提示了在精子变形阶段，DNALI1可能发挥着IDA的LIC组分之外的功能。DNALI1的缺失不影响DNAH1在胞质中的表达，而是单纯性地抑制DNAH1在鞭毛结构中的锚定（图5C）。不同于DNAH1的是，AKAP4在圆形精子细胞质和鞭毛中的表达量均显著降低（图5D-E）。此外，通过免疫共沉淀-质谱鉴定，发现DNALI1在精子胞质中，可与Dynein complex的组分蛋白相结合（图6）。Dynein complex作为胞质中的转运复合体，其结构与IDA高度相似，由DHC、LIC、LC等组分组成。因此，该研究提出DNALI1在精子变形阶段，可能参与组成Dynein complex复合体，发挥着鞭毛组分蛋白的装配功能，如FS组分蛋白AKAP4的运输。
图5. DNALI1定位于圆形精子胞质，影响鞭毛组分的组装。A. DNALI1表达定位于睾丸组织的精子细胞胞质；B. DNALI1首先在圆形精子细胞质中表达，随着鞭毛发生而定位于精子尾部；C. DNALI1的缺失不影响DNAH1的胞质表达，但是抑制DNAH1的鞭毛定位；D. DNALI1的缺失影响AKAP4蛋白的运输与装配；E. AKAP4与DNALI1蛋白相互结合。
图6. DNALI1可与胞质运输体蛋白相互结合，调控鞭毛组分运输。
A-C. DNALI1蛋白的相互作用蛋白的功能注释。除了大量的鞭毛组分蛋白之外，DNALI1与多种Dynein complex组分相互结合；D.模式图显示DNALI1可能在圆形精子变形阶段，在胞质及鞭毛中参与组成胞质运输体，调控鞭毛组分的装配。
DNALI1缺失会导致部分小鼠脑积水。除鞭毛外，IDA同样是动纤毛的重要组成部分。DNALI1缺失导致的IDA结构不全可能会导致更多的纤毛疾病。该研究发现，DNALI1在小鼠脑室纤毛中表达，且近一半的Dnali1-/-小鼠表现出头部明显扩大和脑积水的现象（图7）。提示DNALI1在动纤毛中保守的功能。
图7. DNALI1缺失导致小鼠的脑积水。A-C. DNALI1缺失导致过半数小鼠的脑积水症状；
D. DNALI1表达定位于动纤毛。
ICSI可解决DNALI1缺失导致的男性不育。该研究团队依托于安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心，对该夫妇进行ICSI周期治疗，并在植入一个冷冻解冻胚胎后，成功妊娠。卵母细胞的受精率和胚胎发育率（囊胚率）分别为100%和50%。最终该夫妇获得一名健康的男婴，足月妊娠。表明ICSI可有效作为DNALI1缺失型AZS的治疗手段。
图8. DNALI1作为细胞质动力蛋白复合物的一部分参与调节鞭毛成分的运输组装过程
文章结论与讨论，启发与展望
本研究首次系统性地证实DNALI1对维护人类和小鼠精子鞭毛正常的亚细胞结构和运动功能是至关重要的。此外，揭示了DNALI1在精子发生过程中调控IDA/FS的组装和协调鞭毛结构组分在胞质转运中的重要意义。该研究扩大了我们对特发性AZS致病基因的认识。未来工作中，我们也将继续致力于探索人类特发性弱精子症的致病性遗传变异，期望通过这些研究为人类AZS的临床精准诊疗提供理论依据。
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通讯作者：
曹云霞，医学博士，主任医师，二级教授，博士生导师，安徽医科大学妇产科学系主任。国家卫健委配子与生殖道异常研究重点实验室主任，教育部生命资源保存与人工器官教育部工程研究中心主任，安徽省生育力保存与人工器官工程技术研究中心主任，生殖健康与遗传安徽省重点实验室主任，安徽省“115”产业创新团队负责人，安徽省学术技术带头人。妇幼健康研究会生殖医学专委会主任委员，中国医师协会生殖医学专委会副主任委员，中国医师协会遗传学分会副会长。享受国务院特殊津贴，国家卫生健康突出贡献中青年专家，全国优秀科技工作者。主持包括国家重大基础研究计划、国家新药创制重大项目、国家自然基金项目等国家级和省级课题40余项。“2014年度中国十大科学进展”获得者。先后获得省科技进步一等奖3项，中国妇幼健康科技奖一等奖2项。发表包括《Cell》、《Nat Genet》、《The Lancet》、《N Engl J Med》、《Am J Hum Genet》、《Advanced Science》等SCI收录论文200余篇。安徽省科协副主席（兼）。
贺小进，主任医师，教授，上海交通大学博导，博士后合作导师。上海市第一人民医院生殖医学科主任，国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室特聘教授。兼任中国医师协会生殖医学专委会青委会副主委，中国康复医学会生殖医学专委会常委等学术任职。长期从事生殖医学临床工作和生殖遗传与环境病因学基础研究。国家重点研发计划子课题课题组长，主持国自然面上项目3项。以通信/第一作者在《Nature Communications》、《America Journal of Human Genetics》、《JAMA Network Open》、《Nucleic Acids Research》、《eBioMedicine》等国际著名学术期刊发表SCI论文50余篇。研究成果被OMIM数据库引用17次，成为人类遗传数据的重要组成部分。作为主要完成人获全国妇幼健康科学技术奖一等奖2项，安徽省科学技术进步奖一等奖1项，中国出生缺陷干预救助基金会科学技术奖——青年学者奖获得者。
花荣，生殖医学博士，硕士生导师，安徽医科大学国家卫生健康委配子与生殖道异常研究重点实验室副研究员，安徽省优秀青年基金获得者（2022年）。研究方向：1，男性不育与精子发生的机制；2，受精及胚胎发育的男性因素研究；3，精子的表观遗传对胚胎发育及子代健康的调控机制。主持国家自然科学基金2项。以（共同）第一或通讯作者在《Nucleic Acids Research》、《PNAS》、《Science China Life Sciences》、《Human Reproduction》、《Human Molecular Genetics》等期刊发表SCI论文多篇。《Cellular and Molecular Life Sciences》、《Journal of Human Genetics》等杂志专业审稿人。
吴欢，医学博士，硕士生导师，安徽医科大学第一附属医院副主任医师。安徽省第一届卫生健康骨干人才和安徽省教育厅高校优秀青年骨干人才。研究方向：配子发生异常的遗传学病因及其致病机制研究。主持国家自然基金青年项目1项，省级科研课题3项以及校级科研课题2项。获2021年全国妇幼健康科学技术奖一等奖1项。以第一作者或通讯作者（含共同）发表包括《Am J Hum Genet》、《Cell Death & Disease》、《Science China Life Sciences》和《Human Reproduction》等SCI收录论文20余篇。
