2024年5月16日，安徽医科大学第一附属医院/国家卫健委配子与生殖道发育异常研究重点实验室曹云霞/吴欢/花荣团队联合上海交通大学医学院附属第一人民医院贺小进/南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室刘明兮/张金涛在SCIENCE CHINA Life Science（IF：9.4）杂志发表了题为“Adenylate kinase phosphate energy shuttle underlies energetic communication in flagellar axonemes” 的研究论文[1]。该研究揭示了睾丸优势表达的腺苷酸激酶家族亚组Ⅲ的AK8和AK9调控精子鞭毛的能量转运和运动的功能及机制，为深入理解哺乳动物精子能量代谢、探索男性不育的潜在治疗方法提供了新的视角。
弱精子症是最常见的男性不育病症之一，给家庭和社会都造成影响。目前仍有相当比例的弱精子症病因不明，被称为特发性弱精子症，对其病因和发病机制的探究一直是男性不育研究领域的一大热点[2,3]。既往对于特发性弱精子症致病机理的研究主要集中在鞭毛（精子驱动器）的发生异常和三磷酸腺苷（ATP，精子能量来源）的生成障碍方面。但精子运动的维持除了需要完整的鞭毛结构和充足的能量供应之外，还需要正常的鞭毛内ATP转运[4]。ATP在精子鞭毛表面的附属结构（线粒体、纤维鞘）内合成后，需要穿越多个亚细胞结构才能到达鞭毛内部，最终被轴丝动力蛋白臂水解产生能量[5]。在哺乳动物中，调控鞭毛内ATP转运的分子机制仍不明确。
腺苷酸激酶（AK）广泛存在于生物体内，尤其是在需要高水平合成和利用ATP的细胞中（如心肌细胞、骨骼肌细胞和精子）大量存在，参与细胞内能量和核苷酸代谢。AK催化可逆的磷酸转移反应：将一个三磷酸腺苷（ATP）分子上的高能磷酸基团（Pi）转移到一个单磷酸核苷酸（AMP）分子上，形成两个二磷酸腺苷（ADP）分子（ATP+AMP<=>2ADP），反之亦然。因此，AK通过维持细胞内不同腺嘌呤核苷酸间的动态平衡来实现Pi的循环传递，从而调控能量的转运和流动[6]。AK8和AK9主要表达于人的睾丸组织中，但它们是否通过调控ATP转运参与精子运动？相互作用及调控机制是什么？
严谨设计 构建模型
研究团队发现AK亚组亚(AK7、AK8、AK9)优势表达于雄性睾丸组织中，提示它们具有潜在的生殖生物学功能。随后研究者们构建了小鼠同源基因Ak8和Ak9敲除模型，并通过运用免疫沉淀结合质谱分析(IP-MS)、免疫荧光(IF)、蛋白印迹(WB)和代谢组学分析等技术，综合利用多种基因缺失模型及病例样本，对AK8/AK9调控鞭毛内ATP转运、决定精子运动的分子机制进行了深入解析。
步步深入 反复验证
研究团队通过转录组学分析，对AK家族在小鼠体内各重要脏器中的表达情况进行了分析，结果显示AK亚组Ⅲ（AK7、AK8、AK9）优势表达于雄性睾丸组织中。此外抑制AK活性后可显著降低小鼠精子的运动功能，而抑制CK活性后精子活力则没有明显改变。该结果突显了AK在调控精子能量代谢中扮演着关键的角色。
通过全外显子组测序技术，在AZS患者队列中鉴定出3例携带AK8或AK9基因纯合突变的罕见病例。这些纯合变异包括AK8的错义突变（c.2T>G:p.M1R），AK9的移码突变（c.2350_2362del）和无义突变（c.3973A>T:p.K1325X）。利用自制的特异性抗体通过IF和WB分析，证实突变患者精子样本中的AK8或AK9蛋白显著减少或完全缺失。
为了明确AK8和AK9缺失与弱畸精子症的相关性，研究者构建了Ak8-/-和Ak9-/-小鼠模型。表型分析发现，Ak8-/-小鼠的存活率不受影响，但表现出完全的雄性不育性，表明Ak8-/-小鼠的生育力表型与AK8突变患表型高度一致。精子质量分析显示，这些小鼠的精子活力严重受损。形态学检测显示Ak8-/-精子的结构基本正常，仅有少量精子的鞭毛中段存在异常变细的现象。此外，Ak8-/-精子的ATP水平存在显著降低的改变。
Ak9-/-小鼠的生育力表型同样与AK9突变患表型高度一致。Ak9-/-精子在形态上没有明显异常，且精子鞭毛中的蛋白组份如GAS8、RSPH3、RSPH9和DNALI1等无异常改变，但Ak9-/-精子同样存在严重的运动功能障碍。此外，Ak9-/-精子中的ATP水平同样是显著降低，表明AK8和AK9均在精子能量代谢中起着至关重要的作用。
为了进一步探索AK8和AK9的生殖生物学功能，研究者利用小鼠睾丸组织，通过IP-MS发现AK8与辐轮结构（RSs）的头部蛋白RSPH3B相互作用；而AK9则与RSs的另一个组分RSPH9相互作用。上述结果提示AK8/AK9的亚细胞定位可能与RSs相关。随后，我们分别检测了Iqub-KO（RS1缺失）和Lrrc23-KO（RS3缺失）小鼠精子细胞中AK8/AK9的表达情况，并最终明确：AK8的定位与RS2相关，而AK9锚定于RS3。
为了探究AK8或AK9缺失对鞭毛ATP转运的影响，研究者对Ak8-/-和Ak9-/-精子鞭毛的ATP定位进行了检测，发现与正常对照相比，Ak8-/-鞭毛主段ATP信号显著下降，而Ak9-/-鞭毛主段ATP信号异常增宽弥散。提示AK8可能调控ATP由鞭毛中段向主段的转运；而AK9可能调控ATP向轴丝微管的中心富集——当AK9缺失时可能会导致ATP因转运障碍无法向轴丝定位和富集，从而在鞭毛主段呈弥散状态。上述结果表明，AK8/AK9作为精子“ATP转运酶”锚定于不同的放射轴幅亚细胞结构，协同调控鞭毛内ATP的转运和定位，从而决定精子的运动能力。
为了揭示AK9的催化底物及调控的代谢路径，研究者分析了Ak9-/-小鼠精子的代谢组。结果显示，Ak9-/-精子的核苷酸降解途径活性增强，腺苷水平显著下降，提示ATP转移障碍可能导致核苷酸的无效利用。同时，核苷酸的磷酸转化、ATP/ADP、ADP/AMP、UTP/UDP比率的降低，进一步强调了AK9在精子能量代谢中的核心作用。此外，ATP的主要生成途径即糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS），并未受到显著影响。
解析结果 回归临床
本研究深入探讨了睾丸优势表达AK亚组亚中的AK8和AK9在雄性生殖系统中的功能。通过动物模型的构建，研究者们明确了AK8和AK9的亚细胞定位，并解析了AK8/AK9调控鞭毛内ATP转运、决定精子运动的分子机制。此外，研究者还在弱畸精子症患者队列中鉴定出3例携带AK8或AK9基因的罕见纯合突变的病例，进一步证实AK8和AK9基因缺陷是人和小鼠弱畸精子症的致病因素。该研究成果进一步丰富了男性不育遗传学病因，为患者的遗传咨询和临床精准干预提供了重要的理论依据。
总结经验 展望未来
本研究团队通过深入分析AK8和AK9在精子鞭毛轴丝中的作用，提供了对精子能量代谢和运动机制的新见解。未来的研究可以进一步探索AK8和AK9在精子能量代谢中的确切角色和调控机制。同时，深入探究AK家族亚组Ⅲ成员在精子能量转运中的协同作用将有助于揭示精子运动的分子机制，为精确诊断和治疗男性不育提供新的策略和靶点。
安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心吴欢副教授/李玉倩硕士研究生、南京医科大学张晏蔓博士研究生/孙叔雅硕士研究生、南京医科大学第一附属医院张金涛博士后为该文章的共同第一作者；上海交通大学贺小进教授、南京医科大学刘明兮教授和安徽医科大学曹云霞教授/花荣副研究员为通讯作者。该研究的得到国家重点研发项目、国家自然科学基金项目资助。
参考文献：
1. Wu H, Zhang Y, Li Y, Sun S, Zhang J, Xie Q, Dong Y, Zhou S, Sha X, Li K, Chen J, Zhang X, Gao Y, Shen Q, Wang G, Zha X, Duan Z, Tang D, Xu C, Geng H, Lv M, Xu Y, Zhou P, Wei Z, Hua R, Cao Y, Liu M, He X. Adenylate kinase phosphate energy shuttle underlies energetic communication in flagellar axonemes. Sci China Life Sci 2024.
2. Tu C, Wang W, Hu T, Lu G, Lin G, Tan YQ. Genetic underpinnings of asthenozoospermia. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2020;34(6):101472.
3. Ortega C, Verheyen G, Raick D, Camus M, Devroey P, Tournaye H. Absolute asthenozoospermia and ICSI: what are the options? Hum Reprod Update 2011;17(5):684-92.
4. Ford WC. Glycolysis and sperm motility: does a spoonful of sugar help the flagellum go round? Hum Reprod Update 2006;12(3):269-74.
5. Amelar RD, Dubin L, Schoenfeld C. Sperm motility. Fertil Steril 1980;34(3):197-215.
6. Tombes RM, Shapiro BM. Metabolite channeling: a phosphorylcreatine shuttle to mediate high energy phosphate transport between sperm mitochondrion and tail. Cell 1985;41(1):325-34.
