【Hum Reprod】安徽医科大学曹云霞吴欢课题组发现罕见遗传突变导致不孕不育，为临床患者提供个性化遗传咨询和精准治疗方案

TFF (Total fertilization failure，完全受精失败)是指MII期卵母细胞无法完成受精的过程，有1-3%的ICSI失败是源于TFF。TFF与精子及卵子的异常均有关，精子因素主要是PLC家族蛋白的结构、表达和定位异常。受精失败的遗传学机制目前尚不明确，截至目前已鉴定到一些遗传突变与两种配子的功能相关。精子中鉴定到最多突变的是PLCZ1，卵子中的突变基因包括WEE2，TLE6，TUBB8，PAT1和PATL2等。另外，精子卵子融合关键因子JUNO也发挥了重要作用。

精子缺陷导致的TFF在临床上的症状往往较为隐匿，目前预测受精失败的检测手段有限，容易误导临床诊疗方案的制定，深入了解导致男性因素TFF的遗传机制具有重要的临床意义。Calreticulin 3（CALR3）是睾丸特异性钙网蛋白家族的一员，研究表明，在Calr3基因敲除的小鼠模型中，精子无法从子宫迁移到输卵管，并且丧失了与卵母细胞ZP结合的能力，从而导致雄性不育。然而，在人类中目前尚未有与CALR3突变相关受精失败的病例报道。

针对以上科学问题，2024年9月5日，国际生殖医学研究领域权威学术期刊《人类生殖》【Human reproduction IF=6.0】在线发表了安徽医科大学第一附属医院/国家卫健委配子与生殖道发育异常研究重点实验室曹云霞教授和吴欢副教授课题组联合上海交通大学医学院附属第一人民医院贺小进教授的研究“CALR3 defects disrupt sperm-zona pellucida binding in humans: new insights into male factor fertilisation failure and relevant clinical therapeutic approaches”。该研究发现了睾丸特异性表达的钙网蛋白家族成员基因CALR3的罕见突变导致精子中ZPBP蛋白缺乏和顶体超微结构缺陷，进而导致成熟精子无法结合卵子透明带，引起TFF和男性不育。

该研究进一步加深了人类对精子缺陷相关TFF的遗传基础的理解，并为这类患者的诊断和生育建议提供了理论依据。

1. 临床样本采集：75例以精子头部畸形为特征的畸形精子症不育男性；

2. 全外显子组测序分析：采集外周血展开了全外显子组测序(WES)检测与分析验证。【DNA样本片段化后建库，采用Exome芯片捕获（Agilent SureSelect Human All Exon V6 60M捕获芯片）联合使用SNPscan测序数据验证试剂盒对96个高频SNP位点进行验证确认二代测序数据准确性。以上测序验证分析均由Genesky Biotechnologies Inc., Shanghai, China上海天昊生物科技有限公司完成】。经过质量控制与序列比对后，运用生物信息学工具对测序数据予以分析，尤其关注可对蛋白功能产生影响的变异，同时通过Sanger金标准测序平台“对候选变异进行验证。

3. 精液与功能分析：以此评估精子质量，同时进行透射电镜观察，以了解精子的超微结构。

4. 蛋白质功能验证：通过免疫荧光，Western Blot，质谱分析等技术，在突变精子中检测透明带结合蛋白（ZPBP）的存在与否。使用体外细胞模型，评估CALR3的表达情况，验证突变是否影响蛋白质的正常表达和功能。

5. 辅助生殖技术的应用：使用亚透明带注射（Subzonal Insemination, SUZI）和卵胞质内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）两种辅助生殖技术来处理由于CALR3缺陷而导致的未能完成受精的问题，不需要额外的辅助卵子激活（Assisted Oocyte Activation, AOA）措施。

本研究首次在两名无亲缘关系的不育患者中发现了CALR3双等位基因突变，这些患者呈现出以精子头部畸形为特征的原发性不育症。综合研究表明，这些罕见的突变致使受影响的精子中ZPBP缺乏和顶体分离，从而造成精子与透明带结合受阻，进而导致TFF。鉴于ICSI治疗后，CALR3突变型精子实现了成功受精并获得良好的妊娠结局，且突变精子中PLCζ的表达正常，团队得出结论，ICSI是CALR3突变型精子治疗的最佳方法且不需要AOA进行补救。

对男性不育的理解：该研究强调了CALR3在精子与透明带结合中的关键作用，为理解男性因素导致的未能完成受精（FF）提供了新的视角。

个性化遗传咨询：研究结果为携带CALR3突变的患者的个性化遗传咨询和临床治疗提供了有价值的参考依据。

辅助生殖技术的选择：研究证明了ICSI和SUZI的有效性，为CALR3缺陷相关的不育症患者提供了有效的治疗方案，避免了无效的长期药物治疗。临床医生必须对男性因素导致的TFF的潜在病因保持高度警惕，其可归因于遗传缺陷，特别是在表现出精子头部畸形的不育男性中。这种预防措施有助于为受影响的夫妇提供基于证据的个性化治疗。